O método de acetólise

1. O material deve ser colocado em tubos de centrífuga graduados e com fundo cônico e deve-se acrescentar 10ml ácido acético glacial;
2. centrifugar o material durante 5 minutos a 2.000rpm;
3. eliminar o sobrenadante;
4. preparar a mistura de acetólise que consiste em juntar ácido sulfúrico mais anidrido acético (1:9);
5. colocar 5ml dessa mistura dentro de cada tubo;
6. levar os tubos com a mistura, ao banho-maria, durante mais ou menos 2 minutos a 100oC;
7. centrifugar a mistura ainda quente durante 5 minutos a 2000rpm;
8. eliminar o sobrenadante;
9. colocar no tubo 10ml de água destilada mais uma gota de álcool;
10. centrifugar e eliminar o sobrenadante novamente;
11. acrescentar nos tubos 5ml de uma mistura de água destilada mais glicerina (1:1) e deixar o material nesta mistura de 30 minutos a 24 horas;
12. centrifugar, eliminar o sobrenadante e colocar o tubo de boca para baixo sobre papel de filtro.

Montagem das lâminas

1) Usando um estilete esterilizado, retirar uma pequena porção de gelatina glicerinada (aproximadamente 2mm de diâmetro);
2) tocar o material depositado no fundo do tubo com a gelatina de modo que algum material fique preso na gelatina;
3) colocar o conjunto em uma lâmina de microscópio. É necessário montar três lâminas para cada material a ser analisado;
4) aquecer a lâmina para a fusão da gelatina com o auxílio de uma placa aquecedora;
5) colocar a lamínula delicadamente sobre o material;
6) colocar novamente a lâmina sobre a placa aquecedora e aplicar parafina derretida em um dos lados da lamínula com o auxílio de um estilete. A parafina, rapidamente, penetrará por capilaridade no espaço entre a lâmina e a lamínula, contornando a preparação de gelatina glicerinada que contam os grãos de pólen;
7) vire as lâminas com a lamínula para baixo sobre um papel de filtro. Enquanto a parafina solidifica, os grãos de pólen depositam-se junto à lamínula, facilitando dessa forma a observação dos grãos de pólen.

Dicas

1) Use uma capela para absorver os vapores dos ácidos utilizados no processo de acetólise porque todos eles são tóxicos.
2) Algumas famílias botânicas apresentam grãos muito frágeis. Se esse for o caso de algum dos materiais que serão acetolisado pode-se fazer duas coisas: diminuir o tempo em que o material permanece em banho-maria (fase 6 do método da acetólise) e/ou colocar pedaços bem pequenos de massinha de modelar nos quatro cantos da lamínula, para evitar que ela pressione e deforme os grãos de pólen. Há casos porém em que os grãos são sensíveis demais e acabam sendo totalmente destruídos pela acetólise, mas estes casos são exceções. Porém, é prudente ter isso em mente e até que se tenha idéia de quais são as plantas da região estudada que possuem essa característica, sugere-se que seja montada uma lâmina a fresco.
3) Alguns grãos apresentam formatos que dificultam em muito sua observação, pois eles tendem a cair sempre em uma determinada posição. Nesses casos, pode-se preparar uma lâmina da seguinte forma. Com o auxílio da gelatina glicerinada, coloca-se um pouco do material centrifugado sobre a lâmina. Descarta-se então a gelatina glicerinada e deposita-se uma gota de uma mistura de água destilada e glicerina líquida (1:1), sobre o material na lâmina. Coloca-se então a lamínula sobre o material. A lâmina deve ser posta no microscópio e usando um estilete, deve-se tocar cuidadosamente a lamínula de tal forma a causar a movimentação dos grãos de pólen, que rolarão livremente na gelatina líquida. Ao mesmo tempo, deve-se observar o grão no microscópio. Dessa forma será possível ter idéia de como é o formato do grão. A lâmina preparada dessa forma pode ser depois descartada ou então protegida com parafina, como descrito acima.